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    杭州ag8亚游集团生物技术有限公司

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    实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)技术服务

    服务背景
    实时荧光定量PCR技术是生命科学领域的一项重要技术,是快速检测基因表达水平的首选方法。qPCR实验步骤繁多,后续的数据处理工作也颇为复杂,一些科研工作者往往花费了很多的时间和精力却仍得不到满意的qPCR结果。
    ag8亚游集团生物可根据客户需求和实验目的,为您设计切实可行的实验方案,全程采用符合国际标准的进口试剂完成实验,最终提供给您一份客观翔实的实验报告及符合论文发表标准的图表。帮您完美解决qPCR实验过程中的一切问题,让您能不再为技术问题而烦恼,有更多的精力和时间聚焦科学问题!
     
    实验原理
    实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团(包括荧光染料或荧光标记的特异性探针),对PCR产物进行标记跟踪,随着PCR反应的进行,反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一次荧光强度信号,这样即可通过荧光信号强度的变化实时监测整个PCR过程中产物量的变化,并结合相应软件对产物进行分析,可以得到荧光扩增曲线,从而计算待测样品中目的基因初始模版的量,常用于分析目的基因的表达水平的变化。
     
    服务内容
    相对定量qPCR包括:
    mRNA引物/探针设计以及表达检测服务
    lncRNA引物/探针设计以及表达检测服务
    miRNA引物/探针设计以及表达检测服务
    circRNA引物/探针设计以及表达检测服务
    对各类型样本中各种RNA差异表达相对定量。每个样本重复三次,我公司可提供常用内参基因引物。
    实验流程:
    1、客户提供目标基因序列以及表达量等相关信息
    2、根据目的基因序列设计并合成特异性引物/特异性TaqMan探针
    3、抽提RNA,逆转录RT-PCR及cDNA扩增
    4、PCR反应条件优化
    5、qPCR样品正式上机分析(采用SYBR Green I法或TaqMan探针法两种方式)
    6、数据分析(可根据客户要求制作相关图表;一般采用2-ΔΔ Ct法进行计算。)
    绝对定量:
    需要制备标准品并建立标准曲线,然后检测目的样本中的基因,比对标准曲线得到基因准确拷贝数。常用于质粒拷贝数计算、DNA拷贝数分析等。
    实验流程:
    1、客户提供基因序列以及相关信息
    2、根据序列设计并合成引物
    3、抽提RNA/DNA,扩增目的片段,连接载体,制备质粒标准品
    4、建立标准品稀释梯度,上机分析,绘制标准曲线
    5、根据标准曲线以及目的基因上机分析结果计算目的基因拷贝数
     
    服务优势
    检测内容覆盖全面,针对多类型RNA制定不同的实验方案
    丰富的特殊样品项目经验(比如血液,石蜡组织等各类复杂特殊样本)
    引物设计经验丰富,可根据客户需求和RNA种类设计高质量引物
    进口高效染料搭配最新定量仪器,提供准确可靠的数据结果
    实验结果报告翔实可靠,可根据客户需要绘制可用于发表的图表
     
    服务流程
    1、客户提供需要检测的基因名称、登录号或序列
    2、确认客户样品数量、种属、样本类型
    3、我司技术部根据客户提供的信息设计好实验方案,销售做出报价合同
    4、客户确定无误后签订《ag8亚游集团生物-qPCR检测服务合同》,并签字(或盖章)
    5、支付项目预付款,服务正式启动
    6、提供实验样品(细胞、组织、血液等)
    7、技术员根据合同实验方案开展实验
    8、实验结束后,发送初步实验报告
    9、支付项目尾款
    10、提供详细实验报告,完成实验项目
     
    样品提交说明
    1、实验所需的样品:
    组织或者细胞:提供尽可能多的新鲜组织或细胞样品(包括3个技术重复),样品量:组织样品不少于200 mg,细胞至少107­­
    RNA: 直接抽提好的的总RNA量大于5ug或者mRNA大于200ng( 注:OD260/OD280在1.9-2.1之间,完整性好)
    DNA:总DNA大于5ug(OD260/OD280在1.7-1.9之间,完整性好)
    2、提供尽可能详细的背景资料:样品来源、目的基因丰度等
    3、引物、探针、标准品(可由客户自己提供,也可由公司直接设计提供)
     
    结果交付
    1、实验所需的试剂和仪器说明
    2、RNA或DNA提取质量检测电泳图
    3、定量检测原始数据(包括扩增曲线、溶解曲线)
    4、详细的项目结题报告(包括实验报告和结果分析报告)

    结果展示


    相对定量—特异性引物融解曲线(单一峰)


    绝对定量—标准品稀释梯度样品扩增曲线


    qPCR和RNA-seq检测结果比较图


    不同基因qPCR和RNA-Seq检测结果关联性分析

    常见问题解答

    1、绝对定量和相对定量有什么差异?

    2、荧光定量PCR SYBR Green I法引物和TaqMan探针的设计原则分别是什么?
    SYBR Green I法引物:
    1)扩增产物长度在80-200 bp;引物应在核酸序列保守区内设计并有特异性;引物通常设计为跨内含子。
    2)产物不能形成二级结构;引物长度在18-30 bp之间,其中碱基应随机分布;待扩增的片段Tm值应在55-65 ℃之间;待扩增的片段GC含量在40-60 %之间;引物自身及引物之间不能有连续4个碱基的互补。
    3)引物5′端可进行修饰,3′端不能进行修饰; 引物3′端要避开密码子的第3位。
    TaqMan探针:
    TaqMan探针的设计原则为尽量靠近上游引物;长度一般为30-45bp,Tm 值至少比扩增引物高 5 ℃;5′端不能为 G,因为 G 会淬灭荧光,从而影响定量;设计时,需要通过软件来进行设计,网络上有许多免费的以及在线的设计软件可以使用。

    3、判断扩增曲线是否良好的指标有哪些?
    1)曲线拐点清楚,特别是低浓度样本指数期明显。
    2)曲线指数期斜率与扩增率成正比,斜率越大扩增效率越高。
    3)标准的基线平直或者略微下降,无明显的上扬趋势。
    4)各管的扩增曲线平行性好,表明各反应管的扩增效率相近。
     
    4、荧光定量PCR有哪些注意要点?
    荧光定量PCR的关键步骤在于RNA的抽提和引物的设计。RNA的抽提需要严格进行RNase free的操作,抽提的RNAOD260/OD280需严格控制在1.9-2.1之间。引物设计主要的考虑是其PCR反应特异性好和扩增效率高,进行PCR反应时无非特异性的条带和引物聚合体出现。
    除此之外,其他各个环节如试剂的稳定性,RNA反转的质量好坏,PCR上机条件的设定,加样的手法和熟练度等等也要注意。
     
     
    参考文献
    Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001, 25:402–408.
    Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky. PCR Applications: Protocols for Functional Genomics. Academic.
    Shenglin Huang, et al. MicroRNA-181a modulates gene expression of zinc finger family members by directly targeting their coding regions. Nucleic Acids Research, 2010, 1-8.
    Jianhua Xiong, et al. An estrogen receptor a suppressor, microRNA-22, is downregulated in estrogen receptor a-positive human breast cancer cell lines and clinical samples. The FEBS Journal 277 (2010) ,1684–1694.

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